想要准确诱导RAW2647细胞转变为促炎的M1“战士”或抗炎的M2“修复者”？您的寻找到此为止！这份详细的RAW2647细胞M1/M2极化方案，一次性为您提供了从试剂配比到操作细节的完整信息。

细胞类型

使用的小鼠单核巨噬细胞系为RAW2647。请注意，细胞的传代次数不应过多，建议保持在10代以内。

培养基及试剂信息

• 培养基：高糖DMEM
• 血清：推荐使用10%的胎牛血清（FBS）
• 抗生素：使用1%的青霉素-链霉素双抗溶液
• 关键诱导剂：LPS及IFN-γ等
• 溶剂对照：使用PBS或细胞培养基

所有细胞因子与LPS建议分装后保存在-20℃或-80℃，以避免反复冻融。使用前需在冰上或4℃慢慢溶解，并用预冷的培养基或PBS稀释至工作浓度。

细胞接种步骤

将细胞以2~3x10⁵ cells/孔的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基。注意，细胞接种密度需适中，以免影响细胞状态。

小心吸弃孔内的旧培养基（可选步骤），可用1-2mL预热的PBS轻轻洗涤细胞表面，以去除残留血清及代谢废物。

极化培养基的更换

• M1组：每孔添加2mL含100ng/mL的LPS和20ng/mL的IFN-γ的完全培养基。
• M2组（以M2a为例）：每孔添加2mL含20ng/mL的IL-4和20ng/mL的IL-13的完全培养基。
• 对照组1：未处理的细胞，仅加2mL新鲜完全培养基。
• 对照组2：溶剂对照，添加含有诱导剂等体积溶剂的完全培养基。

在37℃、5% CO₂的条件下继续培养，建议在24小时收集样品进行检测。针对具体实验目的，时间可调整至6、12、48或72小时，但需预实验验证。

极化表型验证方法

在诱导后24小时，您可以通过以下方法验证极化表型：

• Western Blot/ELISA (蛋白提取)：添加适量预冷的RIPA裂解液，冰上裂解，收集裂解液。检测关键蛋白如iNOS、Arg1和CD206。
• ELISA：检测上清液中TNF-α、IL-6（M1）、CCL17、CCL22（M2a）等细胞因子的分泌水平。
• 流式细胞术：用不含EDTA的胰酶消化细胞，洗涤后重悬于缓冲液中染色，检测M1和M2的表面标志物如CD86、MHC-II及CD206、CD163。
• 免疫荧光：在孔板内进行固定、通透和染色操作，观察细胞形态变化。

细胞形态的观察：M1细胞通常显示更圆、更亮的形态，而M2细胞则可能变得更为拉长和铺展。但形态变化仅作辅助观察，需结合多种方法如qPCR与流式细胞术综合判断极化是否成功。

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